伊斯平斯的作用 - 生物活性 - 靶點活性

發布時間:2018-12-04 19:12:12 編輯作者:活性達人

伊斯平斯圖片

圖片:伊斯平斯結構式

伊斯平斯,英文名Ispinesib,CAS號是336113-53-2。它是一種選擇性,有效和可逆的驅動蛋白紡錘體蛋白(KSP)抑制劑,來自喹唑啉酮,具有抗腫瘤特性。那么它的生物活性是什么?如何做實驗呢?下面讓小編給您詳細說明。

首先我們介紹伊斯平斯的生物活性:

1)體外活性
伊斯平斯是一種有效的,高度特異性的KSP抑制劑,Ki app為1.7 nM [1]。伊斯平斯(150 nM)抑制BT-474和MDA-MB-468細胞系,GI50分別為45和19 nM [2]。伊斯平斯(SB715992,15和30 nM)抑制PC-3前列腺癌細胞增殖48.65%和52.16%,并分別誘導前列腺癌細胞凋亡1094.88%和1516.70%。伊斯平斯 up調節負責細胞凋亡和細胞周期停滯的基因,并下調負責細胞增殖和存活的基因。金雀異黃素可以增強伊斯平斯的抗增殖和促凋亡活性[3]。

在PC-3前列腺癌細胞中, 伊斯平斯(5 nM 和 30 nM)通過調節信號的基因表達水平,抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡。在乳腺癌細胞系中, 伊斯平斯(7.4 nM–600 nM)具有廣譜抑制活性。在腫瘤細胞系中(Colo205, Colo201, HT-29, M5076, Madison-109,和MX-1),伊斯平斯(IC50=1.2-9.5 nM) 具有很強細胞毒性。

2)體內活性
伊斯平斯(SCID,8 mg / kg;裸劑,10 mg / kg,q4d×3)可降低攜帶ER陽性(MCF7),HER2陽性(KPL4,HCC1954和BT-474)腫瘤異種移植物的小鼠的腫瘤體積, 通過ip進行三重陰性(MDA-MB-468)乳腺癌細胞 每4天一次劑量重復三次[2]。

攜帶移植瘤的小鼠模型, 伊斯平斯(4.5-15 mg/kg)能夠抑制Colo205, Colo201, HT-29細胞生長。在小鼠實體瘤中,用伊斯平斯處理(6 -10 mg/kg ),Madison 109肺癌, M5076肉瘤,及L1210和P388白血病能夠被抑制。攜帶乳腺癌細胞MCF-7, HCC1954, MDA-MB-468,和KPL4移植瘤的小鼠中,伊斯平斯(8-10 mg/kg )抑制腫瘤生長。

我們已經了解了伊斯平斯的生物活性,接下來如何做活性實驗呢?一般來說,有如下的三種方法:

1)細胞實驗
將PC-3前列腺癌細胞以4×103細胞/孔的密度接種在96孔板中。將PC-3細胞溫育24小時,以使其附著于組織培養板的每個孔的表面。然后,用不同濃度的試劑處理細胞并孵育1至3天。首先,分別用15和30nM的伊斯平斯處理PC-3細胞。其次,用7.5或10nM的伊斯平斯加30μM的染料木黃酮對PC-3細胞進行組合處理。最后,用30μM染料木黃酮預處理PC-3細胞24小時,然后用15nM的伊斯平斯處理。用0.3mM Na 2 CO 3(載體對照)處理對照細胞。處理后,將PC3細胞在37℃下與MTT(0.5mg / mL)一起溫育2小時,并在室溫下將異丙醇溫育1小時。然后通過使用ULTRA多功能微板讀數器在595nm處測定每個樣品的分光光度吸光度[3]。

2)動物實驗
腫瘤體積為~250mm 3的小鼠接受單劑量的伊斯平斯(10mg / kg)。解剖腫瘤,固定在10%緩沖的福爾馬林中,并包埋在石蠟中,制備5-μm組織切片。通過在50mM檸檬酸鹽緩沖液(pH5.5)中煮沸來進行抗原修復,然后將切片在3%過氧化氫中溫育,在PBS-0.1%Tween中洗滌,并在10%山羊血清中封閉。使用Alexa Fluor 488二抗檢測磷酸 - 組蛋白H3(PH3)抗體。用顯微鏡以×10放大率拍攝圖像,并使用MetaMorph軟件捕獲圖像,通過計算每個總細胞的PH3陽性細胞的面積比來量化PH3表達。完成Ki67 /切割的胱天蛋白酶-3染色。非熒光圖像在Olympus BX41顯微鏡上以×20放大倍數拍攝[2]。

3)激酶實驗
使用丙酮酸激酶 - 乳酸脫氫酶檢測系統進行驅動蛋白特異性分析,該系統將ADP的產生與NADH的氧化偶聯。在340nm處監測吸光度變化。使用納摩爾濃度的KSP的穩態研究使用基于靈敏熒光的測定進行,所述測定利用丙酮酸激酶,丙酮酸氧化酶和辣根過氧化物酶偶聯檢測系統,其將ADP的產生與Amplex Red的氧化偶聯至熒光試鹵。通過熒光監測試鹵靈的產生(λ激發= 520nm和λemission= 580nm)。在補充有10μM紫杉醇的PEM25緩沖液[25mM Pipes-K +(pH 6.8),2mM MgCl 2,1mM EGTA]中進行穩態生化實驗,用于涉及微管的實驗。在PEM25緩沖液中以500μMATP,5μMMT和1nM KSP測定穩態抑制的IC 50。從濃度 - 響應曲線中提取伊斯平斯的Ki app(表觀抑制劑解離常數)估計值,并對酶濃度進行明確校正[1]。

今天介紹了伊斯平斯的作用,并且詳細地說明了它的生物活性和實驗方法。綜上所述,伊斯平斯Ispinesib是一種特異性的 KSP 抑制劑,Ki app 值為 1.7 nM。它的靶點活性是KSP (HsEg5),1.7nM(Kiapp)。

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參考文獻:
[1]. Lad L, et al. Mechanism of inhibition of human KSP by ispinesib. Biochemistry. 2008 Mar 18;47(11):3576-85.
[2]. Purcell JW, et al. Activity of the kinesin spindle protein inhibitor ispinesib (SB-715992) in models of breast cancer. Clin Cancer Res. 2010 Jan 15;16(2):566-76.
[3]. Davis DA, et al. Increased therapeutic potential of an experimental anti-mitotic inhibitor SB715992 by genistein in PC-3 human prostate cancer cell line. BMC Cancer. 2006 Jan 24;6:22.

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